Простое недорогое устройство позволяет использовать четыре метода эпи-освещения на стандартных световых микроскопах.

1. Дизайн устройства Ключом к методам эпи-освещения, в том числе к тем, которые достигаются нашим устройством,...
2. Обратное рассеяние темного поля
3. эпифлуоресцентной
4. Контрастность отражения помех (IRC)
5. Отражение поверхности темного поля

Дизайн устройства

Ключом к методам эпи-освещения, в том числе к тем, которые достигаются нашим устройством, является отделение сигнала (флуоресцентный, рассеянный, сдвинутый по фазе или поляризации свет, возвращающийся через объектив к детектору) от фона (рассеянный свет в случае флуоресценции и во всех случаях рассеяние или отражение от внешних поверхностей по отношению к образцу, например, между покровным стеклом и объемом образца. Наше устройство (заявлено на получение патента) выполняет это пространственное разделение в плоскости, близкой к задней фокальной плоскости объектива, доступ к которой осуществляется путем сопоставления формы устройства с коммерческими креплениями Wollaston Prism («ползунки DIC»), которые подходят к прорези призмы объектива (часто называется объективной щелью DIC) исследовательского микроскопа. Наше прототип устройства состоит из двух частей: «вставка» и «крепление» ( Рис. 1А, Б ). Вставка содержит ключевой компонент устройства: небольшое горизонтальное зеркало под углом 45 °, расположенное по центру на оптической оси объектива. Крепление в нашем прототипе было разработано для обеспечения бокового перемещения, фокусировки и наклона луча освещения.

Рисунок 1: Прототип эпи-осветительного устройства.

( a ) Устройство ( посередине ) сравнивается по размеру с монетой в 1 пенсов Великобритании ( справа ) и иммерсионным объективом Nikon 100 × ( слева ). Свет попадает в объектив с помощью небольшого зеркала, установленного на «вставной» части устройства, которая соответствует форме «ползунка DIC» Nikon ( внизу ). Остальная часть устройства состоит из держателя для оптического волокна и объектива, который фокусирует свет на зеркало. ( б ) Устройство, установленное на перевернутом исследовательском микроскопе Nikon. ( в ) Схема устройства. На вставке показано изображение задней фокальной плоскости объектива 100 × NA 1,45 с не сфокусированной тенью зеркала стержня 2 мм. Это происходит из-за флуоресцентных шариков 200 нм, застрявших на поверхности покровного стекла, в воде, объектив освещается. ( г ) Лучевая диаграмма устройства в темновом поле с обратным рассеянием и в эпифлуоресцентных модах. Падающие лучи (красные), отраженные зеркалом стержня в объектив и отраженные назад плоскими поверхностями (покровное стекло и предметное стекло), блокируются зеркалом. Свет, рассеянный или испущенный образцом (синие лучи), проходит через зеркало и формирует изображение. Дополнительные фильтры (зеленый) могут использоваться для усиления сигнала и удаления фона. ( e ) 100-кратное поле зрения объектива, показывающее тень, образованную 2-миллиметровым зеркалом стержня с ярким полевым освещением NA = 0,52. Белые и серые пунктирные кружки диаметром 50 и 30 мкм указывают размер пятна освещения, образованного светодиодами и лазером, соединенными через многомодовые и одномодовые волокна соответственно в нашем прототипе.

Зеркало играет двойную роль. Во-первых, он обеспечивает эпиляцию образца путем отражения узкого луча света, выходящего из линзы и оптического волокна на держателе, вдоль оптической оси. Пучок освещения фокусируется для наложения изображения выходной поверхности волокна на заднюю фокальную плоскость (BFP) объектива, обеспечивая келеровое освещение образца (т. Е. Свет из каждой точки волокна коллимируется в образце) ( Рис. 1C, D ). В общем, можно использовать любую комбинацию волокна и источника освещения. Во-вторых, зеркало блокирует освещение, отражаемое непосредственно плоскими поверхностями, особенно освещением любого покровного стекла или предметного стекла, используемого для крепления образца. Если бы зеркало было расположено в задней фокальной плоскости объектива, было бы возможно заблокировать весь такой отраженный свет. Однако слот DIC обычно находится в нескольких сантиметрах от задней фокальной плоскости объектива (в нашей установке ~ 50 мм), и в этом случае отраженный свет блокируется только в тени, отбрасываемой зеркалом ( Рис. 1C, E ). Размер тени зависит от размера зеркала, размера и коллимации освещающего луча. В нашем прототипе зеркало имеет длину 4 мм и 2 мм в диаметре или 2 мм в длину и 1 мм в диаметре (зеркала таких размеров - самые маленькие из имеющихся на рынке зеркал в виде стержней), а тень покрывает область 160 × 60 или 80 × 30. мкм соответственно в поле зрения 220 мкм объектива 100х при ярком освещении Келера.

В этом исследовании мы использовали коммерческий инвертированный микроскоп Nikon, оборудованный 100-кратными объективами Nikon Plan Fluor с регулируемой числовой апертурой (NA 0,5–1,3) и объективом TIRF (NA 1,45); Все изображения, представленные здесь, были собраны с этими целями, если не указано иное.

Мы использовали ряд мощных светодиодов (LED, 300–600 мВт), соединенных в многомодовое шаговое волокно с сердечником 50 мкм, или лазер 632 нм (10 мВт), соединенный с одномодовым волокном. Интенсивность освещения, измеренная на образце, составила 15,3 мВт / мм2 и 960 мВт / мм2 для светодиода и лазера соответственно. Мы использовали асферические линзы с фокусным расстоянием 11 мм и 4,6 мм для коллимации лазерного и светодиодного освещения соответственно, и линзы с фокусным расстоянием 100 мм для фокусировки освещения на объектив BFP. Эти компоненты обеспечивали освещение с NA = 0,28 и круглым полем диаметром 50 мкм для светодиодов, а NA = ~ 0,015, диаметром поля 30 мкм для лазера (пунктирные кружки, Рис. 1E ).

Для количественной характеристики производительности микроскопа с нашим устройством мы использовали усовершенствованную цифровую камеру (Andor iXon Ultra 888, цена по прейскуранту ~ 25 000 фунтов стерлингов), а для демонстрации низкой стоимости нашего устройства мы использовали гораздо более дешевое цветное видео (Watec). 0,3-мегапиксельная аналоговая модель WAT221S, ~ £ 200) и цифровые (Aptina 5-мегапиксельная цифровая модель DK5.1P, ~ £ 1300) камеры.

Механическая стабильность освещающего луча была ограничена посадкой вставки в слот DIC, которую мы не пытались определить количественно. Мы делали снимки только в режиме широкого поля и никогда не обнаруживали никаких движений или колебаний поля освещения при нормальных условиях просмотра, что свидетельствует о достаточной механической устойчивости. Вставка была сделана из алюминия, выбранная для простоты обработки и низкого теплового расширения для заданного количества поглощенного тепла. Мы не обнаружили каких-либо эффектов теплового расширения в наших экспериментах, причем все они проводились при комнатной температуре.

Оптическое разрешение

Тень не в фокусе зеркала стержня нашего устройства в задне-фокальной плоскости объектива TIRF показана на Рис. 1С вставка Чтобы обеспечить заполнение BFP, мы визуализировали плотный слой флуоресцентных шариков диаметром 200 нм, прикрепленных к поверхности покровного стекла, в воде, с обычной эпифлуоресценцией. Яркий кружок на изображении очерчивает NA 1,33, соответствующий свету, связанному с шариками, в объектив через воду, в то время как окружающее диммер кольцо образуется светом, связанным непосредственно с защитным стеклом, и очерчивает полный 1,45 NA объектива. Тень зеркала представляет собой оптическую маску в BFP, которая уменьшает разрешение и нарушает осевую симметрию оптической системы. Это иллюстрируется в Рис. 2 , который сравнивает функции рассеяния точки (PSF) и функции передачи модуля (MTF) с и без устройства, вставленного в теоретические PSF и MTF. Устройство немного расширяет PSF и асимметрично ожидаемым образом: некоторые пространственные частоты теряются в MTF, но полная ширина на половине максимума (FWHM) PSF практически не изменяется. PSFs в Рис. 2 были аппроксимированы высоко увеличенными (40 нм / пиксель изображения) флуоресцентными изображениями с квантовыми точками 20 нм при обычном флуоресцентном освещении EPI. Светодиодная EPI-флуоресцентная подсветка с нашим прибором дала те же результаты (данные не показаны), при немного уменьшенной яркости.

Рисунок 2: Функция разброса точек и функция передачи модуля микроскопа с нашим устройством, вставленным в слот DIC.

( a ) Функции рассеяния точек (PSF), аппроксимированные флуоресцентными изображениями (40 нм / пиксель) с квантовой точкой 20 нм, без ( сверху ) и с ( снизу ) устройством в слоте DIC. Мы использовали изготовленную на заказ систему освещения TIRF с белым светом, коммерческий флуоресцентный фильтр и объектив 1.45NA 100x. ( b ) Участки PSF вдоль осей, показанных в A, без устройства (зеленый), с устройством, вдоль длинной (y, синий) и короткой (x, красный) осей крепления зеркала стержня, и для сравнения раздел теоретического PSF без устройства (пунктирный черный). ( c ) Передаточные функции модуля (MTF) изображений, показанных в A. ( d ) Сечения MTF из C по тем же осям, что и в B, и теоретического MTF. Устройство немного снижает разрешение и асимметрично, особенно на промежуточных пространственных частотах вдоль его короткой оси.

Обратное рассеяние темного поля

BSDF был разработан недавно и пока недоступен в продаже. Ранее описанные прототипы BSDF-микроскопов требуют либо серьезных модификаций коммерческих микроскопов. 2 , 9 или разработка изготовленных на заказ микроскопов 1 , В установках BSDF использовались два подхода к освещению образца: большое 45-градусное зеркало с небольшим центральным отверстием, через которое луч освещает образец. 2 или маленькое центральное зеркало, нанесенное на плоскую стеклянную поверхность 2 , 10 или состоящий из небольшого углового зеркала 45 ° 1 , Последний из этих подходов используется в нашем устройстве ( Рис. 1D ). Изображение темного поля наблюдается в тени зеркала стержня, где световые лучи, отраженные от плоских поверхностей (покровное стекло и предметное стекло), блокируются зеркалом, в то время как свет, рассеянный образцом, проходит через зеркало для формирования изображения. Отраженный свет не попадает в зеркало только в том случае, если он исходит далеко от оптической оси (в нашем случае это свет, излучаемый с периферии оптического волокна) и образует интерференционное изображение за пределами тени зеркала (метод IRC, обсуждаемый ниже). Чем дальше от оптической оси излучается свет, тем больше вероятность того, что он пропустит зеркало после отражения, вторгаясь дальше в область тени. В наших прототипах со светодиодной подсветкой присутствовала область полной тени, соответствующая визуализации в темном поле, с оптическими волокнами диаметром 50 мкм или менее, при условии, что освещенность NA на объективе оставалась менее 0,3 и 0,15 для зеркала стержня 2 и 1 мм соответственно.

BSDF предлагает превосходный контраст 1 для небольших объектов на фоне более крупных объектов по сравнению с хорошо известной и имеющейся в продаже микроскопией прямого рассеяния в темном поле (FSDF). Это связано с тем, что более крупные объекты рассеивают свет в основном в прямом направлении, в то время как объекты, меньшие длины волны света, такие как золотые наносферы, приближаются к рассеивателям Рэлея и рассеиваются более равномерно во всех направлениях. 1 , 11 , BSDF в инвертированном микроскопе оставляет образец доступным сверху, в то время как FSDF, использующий темнопольный конденсатор, особенно при больших числовых апертурах, резко ограничивает доступ к образцу. Кроме того, наша установка BSDF не зависит от объективов с низким NA в отличие от FSDF, что позволяет собирать больше света из образца и получать изображения с более высоким разрешением.

Мы сравнили производительность нашего устройства в режиме BSDF с коммерческой установкой FSDF с использованием наночастиц золота 100 нм. Для FSDF мы использовали коммерческий конденсатор сухого темного поля (освещенность NA 0,95–0,75), рабочее расстояние 1 мм и переменный объектив 100 × NA, установленный на NA = 0,5. Для освещения BSDF мы использовали многомодовое оптическое волокно диаметром 50 мкм, соединенное со светодиодом 470 нм. Рис. 3A – D показывает PSF и MTF для двух режимов темного поля. FWHM PSF почти в 3 раза меньше в BSDF, чем в коммерческой установке, иллюстрируя преимущество совместимости BSDF с целями с высоким NA.

Рисунок 3: Характеристики в режиме обратного рассеяния темного поля (BSDF) по сравнению с коммерческим режимом прямого рассеяния темного поля (FSDF).

( a ) Изображения темного поля (40 нм / пиксель) единственного 100 нм золотого шарика с использованием коммерческого FSDF (верх, объектив 100 ×, NA = 0,5; освещение NA = 0,95-0,75, белый свет) и BSDF с нашим устройством ( снизу - объектив 100х, NA = 1,3; освещение синим светодиодом 470 нм через многомодовое оптическое волокно 50 мкм). ( b) Участки изображений в A вдоль показанных осей, и для сравнения показаны участки теоретических PSF для беспрепятственного NA = 0,5 и NA = 1,3 (пунктирный серый и черный). ( c ) Передаточные функции модуля (MTF) изображений, показанных в A. (d) Сечения MTF из C по тем же осям, что и в B, и теоретических MTF. Устройство предлагает значительно более высокое разрешение, чем коммерческая система FSDF, благодаря возможности наблюдения с высоким NA. ( e ) BSDF-изображение золотых сфер размером 10 нм, полученных с помощью лазера 632 нм через одномодовое волокно. ( f ) Контраст (максимальное значение пикселя шарика / среднее значение пикселя фона) для изображений BSDF из 100 (черного), 40 (красного) и 10 нм (синего) золотых сфер и 100 (пунктирного черного) и 45 нм (пунктирного красного) полистирола бусы.

Современные передовые методы, основанные на обратном рассеянии, позволяют получать беспрецедентно высококонтрастные изображения очень маленьких структур, в том числе 100 нм изолированных вирусов гриппа. 11 (BSDF), 20 нм домены липидного бислоя 12 и даже отдельные молекулы белка 13 (обратное рассеяние в сочетании с интерферометрией). Наше простое устройство также позволяет получать высококонтрастные изображения очень маленьких рассеивателей. Рис. 3E показывает типичное поле зрения 10 нм золотых сфер, полученных с помощью нашего устройства, подключенного к красному лазеру. Используя эту конфигурацию устройства, мы наблюдали частицы золота размером 10, 40 и 100 нм с контрастностью 1:60, 1: 140 и 1: 600 (максимальное значение пикселя шарика / усредненное значение фонового пикселя), а также 45 и 100 нм полистирольные шарики с 1 : 100 и 1: 180 ( Рис. 3F ). Производительность коммерческой установки FSDF была намного хуже; например, 100 нм золотые сферы были видны с контрастностью 1: 6, в 100 раз меньше, чем BSDF (данные не показаны), и более слабые рассеиватели не могли быть выделены.

Пищевые вакуоли малярийных паразитов, живущих внутри эритроцитов хозяина, содержат кристаллы коричневого пигмента гемозоина 14 размером до нескольких сотен нм 15 , Паразит образует гемозоин, осаждая свободный гем, продукт распада гемоглобина, который токсичен для паразита, таким образом, изолируя его от его клеток. Из-за его двойного лучепреломления и превосходного рассеяния света гемозоин был предложен в качестве многообещающей цели для неинвазивного быстрого выявления малярии в неокрашенных мазках крови с помощью кросс-поляризационной (xP) микроскопии 16 и ФСДФ 17 , 18 , FSDF дает относительно низкий контраст с отношением сигнал / шум (SNR = максимальное значение пикселя гемозоина / максимальное значение пикселя пустого эритроцита) около 1,5–3, что не позволяет четко идентифицировать инфицированные клетки в скоплениях крови в скоплении людей. 4 , 19 , РФ микроскопия более чувствительна, чем ФСДФ 20 Хотя поляризационные фильтры относительно дороги. Сообщалось, что альтернативный усовершенствованный метод BSDF увеличивает SNR до 50 4 , 19 , что открывает возможность автоматического обнаружения инфекции. Этот метод сочетает в себе визуализацию xP со сложной системой DFSR с углом освещения образца в диапазоне 15–45 °. Другой неинвазивный подход включает интерферометрическую томографическую фазовую микроскопию инфицированных эритроцитов, хотя этот метод требует вычислительных усилий. 21 ,

Мы сравнили производительность нашего устройства в режиме BSDF с коммерческой установкой FSDF для обнаружения малярии путем визуализации препарата неокрашенных эритроцитов человека, инфицированных Malaria falciparum на стадии трофозоита, фиксированных формальдегидом, и смонтированных в изотоническом растворе. Рисунок 4А показывает два поля зрения, каждое из которых содержит одну зараженную клетку при ярком освещении. Рисунок 4B показывает те же поля с использованием коммерческого FSDF (цель NA = 0,5), с SNR ~ 2,5 (C). Для сравнения, изображение xP того же образца дало SNR ~ 10, которое было уменьшено до ~ 5, когда мы попытались объединить его с FSDF (данные не показаны). Рисунок 4D показывает те же поля, отображаемые в BSDF с нашим устройством, с использованием лазерной подсветки в сочетании с xP (слева, поляризаторы перед лазером и камерой, SNR ~ 50) или светодиодной подсветкой на 470 нм без xP (справа, SNR ~ 20). Лазерное освещение без xP дало SNR ~ 20 (данные не показаны), аналогично светодиодному освещению и предыдущим отчетам. 4 , Рисунок 4F – H покажите две зараженные клетки в ярком поле (F), BSDF как в D (G), и оба режима визуализации вместе (H), используя недорогую цветную видеокамеру.

Изображения получали с помощью цифровых камер Andor iXon Ultra 888 ( a- e ) или аналоговых цветных камер Watec WAT-221S ( f- h ). ( а ) Яркие полевые изображения трофозоита Malaria falciparum в эритроцитах, видимые с объективом 1,3 NA 100 ×. Стрелки показывают места, где профили интенсивности были взяты из изображений темного поля тех же полей образца, показанных на B и D. ( b ) FSDF изображения тех же двух полей зрения, что и в A с 0,5 NA 100 × объективом и 0,65– 0,95 NA освещения. ( C ) Соотношения сигнал / шум (SNR) для FSDF, оцениваемые как отношение пиковой интенсивности кристалла гемозоина (желтого цвета) к интенсивности пика мембраны эритроцита (белого цвета). ( d ) Те же поля зрения, что и в BSDF, когда наше устройство подключено к красному лазеру и оснащено кросс-поляризационными фильтрами (слева), или к синему светодиоду без поляризационных фильтров (справа). ( e ) SNR, рассчитанные как в C для BSDF. ( f ) изображение малярии в ярком поле , ( g ) изображение BSDF того же поля зрения, как описано для D. ( h ) сочетание BSDF и освещения в ярком поле.

эпифлуоресцентной

Канонические эпифлуоресцентные установки включают источник света возбуждения и куб фильтра, содержащий либо два фильтра (дихроичное зеркало и фильтр излучения для узкополосного возбуждения лазерами или светодиодами), либо три фильтра (дополнительный фильтр излучения для широкополосного возбуждения ртутными или ксеноновыми лампами). Наше устройство может использоваться вместо фильтрующего куба в эпифлуоресцентных приложениях, когда оно дополнено узкополосным светодиодом для возбуждения флуоресценции. В случае слабого обратного рассеяния на образце наше устройство можно использовать в режиме BSDF для флуоресценции без каких-либо фильтров, поскольку отраженный свет возбуждения блокируется зеркалом. В случае сильного обратного рассеяния на образце для флуоресцентной визуализации требуется один эмиссионный фильтр, но без дихроичного зеркала. Мы протестировали эти режимы EF нашего устройства на флуоресцентных полипропиленовых бусинах, а также на двух микроорганизмах, паразите Leishmania mexicana и одноклеточной зеленой водоросли.

Промастиготы Лейшмании ( Рис. 5 ) имеют очень слабое рассеяние назад при освещении широкополосным светодиодом «теплого белого» света ( Рис. 5B ) и еще слабее с узкополосным УФ-светодиодом 365 нм. Рисунок 5С показывает флуоресцентное изображение той же клетки, что и Рис. 5А, Б , используя UV-LED и без фильтров. Синие пятна - это более яркий кинетопласт ( Leishmania mitochondrion) и диммерное ядро, помеченные ДНК-интеркалирующим голубым флуорофором DAPI. Как показано ранее 22 DAPI связывает богатую AT кинетопластную ДНК лучше, чем богатую GC ядерную ДНК. Рисунок 6 иллюстрирует флуоресцентную визуализацию с использованием нашего устройства с фильтрами и без них. Без фильтров флуоресцентное излучение от сильно рассеивающих 1 микрон зеленых флуоресцентных шариков ( Рис. 6B ) и умеренно рассеивающая зеленая водоросль ( Рис. 6F ) либо перегружается, либо сопоставляется, соответственно, компонентом обратного рассеяния. Размещение подходящего эмиссионного фильтра перед камерой устраняет обратное рассеяние и дает четкое зеленое изображение флуоресцентного шарика ( Рис. 6C ) или красное флуоресцентное изображение водоросли из-за ее хлорофилла ( Рис. 6G ). Коммерческая эпифлуоресцентная установка (флуоресцентный куб с 3 фильтрами и ртутная дуговая лампа) дает похожие изображения с немного улучшенным разрешением (D, H), после согласования интенсивности освещения дуговой лампы (которая может быть в 40 раз ярче) с Интенсивность светодиодов.

(а) DIC-изображение промастиготы Leishmania mexicana, видимой с объективом 100х. (б) BSDF-изображение того же поля зрения, которое видно на нашем устройстве, подключенном к светодиоду теплого белого света через многомодовое оптическое волокно 50 мкм. (c) Эпифлуоресцентное изображение того же поля зрения, которое видно на нашем устройстве, соединенном с УФ-светодиодом 380 нм, которое использовалось для визуализации DAPI-меченого ядра и кинетопласта лейшмании .

Рисунок 6: Эпи-флуоресцентная визуализация объектов с сильным обратным рассеянием на нашем устройстве, дополненная эмиссионным фильтром.

1 мкм зеленая флуоресцентная полипропиленовая бусина ( a - d ) и зеленая водоросль ( e - h ). ( а , д ) Яркое изображение поля образцов. ( b , f ) Обратное рассеяние на образцах, освещенных синим светом возбуждения светодиода 470 нм, подключенного к нашему устройству через многомодовое оптическое волокно 50 мкм и отображаемого нашим устройством без эмиссионного фильтра. ( c , g ) То же поле зрения, полученное с помощью эмиссионного фильтра. ( d , h ) То же поле зрения, полученное с помощью коммерческого набора кубов фильтров и ртутной дуговой лампы.

Контрастность отражения помех (IRC)

Этот метод используется для изучения тесных межповерхностных взаимодействий, таких как клеточная адгезия или динамика липидного бислоя. Современные установки требуют специального объектива со встроенной четвертьволновой пластиной и куба фильтра с двумя поперечно ориентированными поляризаторами и полуотражающим зеркалом 7 , 23 , Изображение формируется мешающими световыми путями, которые были отражены двумя поверхностями, разделенными менее чем длиной когерентности освещающего света, обычно порядка 1 микрона или менее; такие как стекло / среда, среда / мембрана, мембрана / цитоплазма и т. д. Этот метод является количественным для монохроматического освещения, в то время как использование широкого спектра освещения без четвертьволновой пластинки является качественным и обеспечивает радужную интерференционную картину. В нашем устройстве, в отличие от BSDF и EF, где формирование изображения зависит от путей освещения вблизи оптической оси, формирование изображения в IRC зависит от периферийных лучей, возникающих вблизи края волокна и пропускающих зеркало после отражения от плоских поверхностей в образце. Они образуют интерференционное изображение вне тени, отбрасываемой зеркалом ( Рис. 7А ).

Рисунок 7: Метод контрастного отражения (IRC), используемый в нашем устройстве.

(а) Лучевая диаграмма IRC. Периферийные лучи (красные) от ближнего края волокна, отраженные зеркалом стержня в объектив под большим углом, отражаются назад плоскими интерфейсами и проходят через зеркало, чтобы мешать в камере свету, отраженному от других поверхностей в образце (синий ) тем самым формируя интерференционное изображение в зоне, окружающей тень зеркала. (б) Схема метода капли на гидрогелевом бислое (DHB). ДГБ образуются при контакте двух липидных монослоев, самостоятельно собранных в смеси гексадекан / липид, на границе раздела между водной каплей и тонкой агарозной матрицей. (c) Изображение полушария в светлых полях, полученное 5-кратным объективом (вид снизу). (d, f) Край хорошо сформированного бислоя (d) и более толстого дефекта (f) , отображаемого с помощью светодиода теплого белого света, соединенного с 2-миллиметровым стержневым зеркалом-прототипом нашего устройства через многомодовое волокно 50 мкм. (e, g) те же самые области бислоя, видимые в ярком поле, имеют намного более низкий контраст; (h, i) Зона помех значительно больше для зеркала стержня 1 мм и волокна 50 мкм . (h) Временные более толстые пятна в липидном бислое во время образования DHB. (i) Неравномерное осаждение материала краски в полосе маркера на поверхности покровного стекла.

Мы протестировали работу нашего устройства в IRC на липидных бислоях, образованных методом капли на гидрогелевом бислое (DHB). DHB - новый тип модельного липидного бислоя 24 с чрезвычайно улучшенной стабильностью по сравнению с предыдущими черными липидными мембранами и дополнительным преимуществом, позволяющим наблюдать бислой с оптикой с высокой числовой апертурой 25 , DHB образуются при контактировании липидных монослоев, самостоятельно собранных в смеси гексадекан / липид, на поверхности водной капли толщиной менее 1 мм и слоя субмикронной агарозы ( Рис. 7B ); такие бислои покрывают несколько тысяч мкм2 (с). Рисунок 7D показывает край DHB, отображаемого в IRC нашим устройством с зеркалом 2 мм и многомодовым волокном с сердечником 50 мкм, соединенным со светодиодом теплого белого света. Липидный бислой, нижний правый, имеет классический вид «черной липидной мембраны» из-за деструктивного вмешательства, в отличие от области, где бислой не сформирован. Рисунок 7E показывает то же поле зрения в светлом поле, четко иллюстрируя превосходную способность нашего устройства отличать бислой от небислой области. Цифры 7F, G показывают изображения IRC и светлого поля соответственно области DHB, где тонкая линза масла зажата между липидными монослоями, образуя более толстое пятно между отражающими поверхностями. Опять же, повышенная контрастность нашего устройства в режиме IRC очевидна.

Доли поля зрения, представленные темным полем и интерференционными зонами, зависят от относительных размеров зеркала и луча. Для зеркала с большим стержнем и небольшого волоконного сердечника (волоконный сердечник диаметром 2 мм и 25 мкм) зоны помех не существует, поскольку все периферийные лучи блокируются зеркалом (данные не показаны), тогда как для зеркала диаметром 1 мм и В сердцевине волокна 50 мкм зона интерференции значительно больше, чем область темного поля. Последний случай показан в Рис. 7Н, я где в методике DHB переходные более толстые пятна (H), по-видимому, представляют собой сгущающий слой гексадеканового масла, захваченного между липидными монослоями в ходе образования бислоя. Точно так же черная метка чернил на стеклянной поверхности демонстрирует явные помехи из-за ее неравномерной толщины (I). Тень зеркала едва видна, простираясь от верхнего правого края этих изображений.

Отражение поверхности темного поля

Эта техника эпиляции используется в промышленных приложениях для визуализации рельефных особенностей непрозрачных поверхностей. Коммерческий DFSR использует специальный зеркальный куб с отраженным светом в темном поле и промышленные (металлургические) объективы 8 , 26 , Такие объективы сконструированы для размещения дополнительного светового пути внутри ствола объектива, чтобы образовать наклонное освещение поверхности в виде полого конуса, и предназначены для использования на сухих поверхностях без покровного или иммерсионного масла. Обычные объективы в проходящем свете, используемые в исследованиях в области наук о жизни, не подходят для приложений DFSR.

Благодаря своей конструкции наше устройство может использоваться в приложениях DFSR на обычных микроскопах с проходящим светом, оснащенных объективами с обычным проходящим светом вместо промышленных объективов, для тестирования интересующей поверхности без покровного стекла. Конфигурация нашего устройства для DFSR по существу такая же, как и для BSDF со светодиодной связью, с той разницей, что образец представляет собой отражающую поверхность, а не маленькие рассеивающие объекты на прозрачном фоне. Как и в BSDF, лучи, отраженные от больших плоских поверхностей, блокируются зеркалом, в то время как лучи, рассеянные и / или отраженные поверхностными элементами, обходят зеркало и формируют изображение ( Рис. 1D ). Мы обнаружили, что в режиме DFSR наше устройство может работать с объективами различного увеличения. Например, на расстоянии 10 мкм линии непрозрачного предметного микрометра хорошо видны со всеми протестированными объективами (увеличение 5–40 ×) ( Рис. 8А, Б ). Прозрачные поверхности, такие как рисунки фоторезиста на кремниевых пластинах, также могут быть изучены с помощью нашего устройства (C, D).

( a , b ) DFSR шкалы микрометра непрозрачного объекта, отображаемого нашим устройством, соединенным со светодиодом теплого белого света через многомодовое оптическое волокно 50 мкм и объектив с 5-кратным увеличением и объектив с 40-кратным увеличением с дополнительным увеличением в 1,5 раза. Расстояние между шкалами составляет 10 мкм. ( c , d ) Изображения светлого поля и DFSR прозрачной поверхности кремнезема, протравленной фотолитографией, как видно с объективом 40х.