Основополагающий принцип проточной цитометрии, как работает FACS

1. В этой статье будут рассмотрены следующие темы: Что такое проточная цитометрия?
2. Проточный цитометр
3. Прямые сигналы рассеянного света
4. Отбор флуоресценции и флуорофора (флуорохрома)
5. Флуоресцентные светоизлучающие сигналы
6. Общая экспериментальная процедура
7. Базовые приготовления
8. Окрашивание антител
9. Косвенное окрашивание:
10. Внутриклеточное окрашивание:
11. Этапы стимуляции, фиксации и проницаемости клеток
12. Анализ данных

В этой статье будут рассмотрены следующие темы:

Что такое проточная цитометрия?

Проточная цитометрия - это популярный метод клеточной биологии, использующий лазерные технологии для подсчета, сортировки и профилирования клеток в неоднородной жидкой смеси. Используя проточную цитометрическую машину, клетки или другие частицы, взвешенные в потоке жидкости, пропускаются через лазерный луч света одним способом, и взаимодействие с этим светом измеряется электронным устройством обнаружения в виде рассеяния света и интенсивности флуоресценции. Если флуоресцентная метка или флуорохром специфически и стехиометрически связана с клеточным компонентом, интенсивность флуоресценции в идеале будет представлять количество этого конкретного клеточного компонента.

Проточная цитометрия является мощным инструментом, поскольку она позволяет одновременно проводить многопараметрический анализ физических и химических характеристик до тысяч частиц в секунду. Это делает его быстрым и количественным методом анализа и очистки клеток в суспензии. Используя поток, мы можем определить фенотип и функцию и даже отсортировать живые клетки.

FACS - это аббревиатура для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, которая представляет собой метод проточной цитометрии, который дополнительно добавляет определенную функциональность. Используя высокоспецифичные антитела, меченные флуоресцентными конъюгатами, анализ FACS позволяет нам одновременно собирать данные и сортировать биологический образец по практически неограниченному количеству различных параметров. Как и в обычной проточной цитометрии, собираются данные о прямом рассеянии, боковом рассеянии и флуоресцентном сигнале. Пользователь определяет параметры того, как ячейки должны быть отсортированы, и затем машина налагает электрический заряд на каждую ячейку, так что ячейки будут сортироваться по заряду (используя электромагниты) в отдельные сосуды после выхода из проточной камеры. Технология физического разделения гетерогенной смеси клеток на разные популяции полезна для широкого круга научных областей, от исследований до клинических исследований. В настоящее время термины «проточная цитометрия» и «FACS» часто используются взаимозаменяемо для описания этой лазерной биофизической техники. Диаграмма ниже иллюстрирует экспериментальную установку и общую процедуру типичного эксперимента FACS. Популяция смешанных клеток сортируется по отрицательному образцу и положительному образцу, содержащему представляющие интерес клетки, с помощью проточного цитометра.

>> Знаете ли вы, что Boster может сэкономить вам 50% на антителах против потока?

Проверь сейчас

>> Знаете ли вы, что Boster может сэкономить вам 50% на антителах против потока?

Проверь сейчас

Число измеримых параметров, которые могут быть использованы этой технологией для разделения клеточных популяций, огромно - от простого поверхностного иммунного фенотипа до метаболических функций, статуса клеточного цикла, окислительно-восстановительного состояния и содержания ДНК. С момента своего создания FACS широко использовался в биомедицинских исследованиях, клинической диагностике и терапии. Наиболее распространенное использование FACS наблюдается в:
- анализ цельной крови человека для диагностики заболеваний
- сортировка различных фракций клеток крови для манипуляций и / или трансплантации ex-vivo.
- Иммуно-фенотипический анализ мышиной крови для выявления трансгенных / нокаутированных животных
- Сортировка и анализ множества клеточных линий для различных биологических анализов.
- Характеристика и выделение редких типов клеток, таких как взрослые стволовые клетки и клетки, инициирующие рак

Проточный цитометр

Прибор с проточным цитометром состоит из трех основных систем: жидкостей, оптики и электроники. Система текучей среды включает проточную ячейку, куда вводится образец жидкости. Для проточной кюветы требуется оболочка для переноса и выравнивания ячеек или частиц так, чтобы они проходили через узкий канал и пересекались с лазерным лучом (световым лучом) в одном файле. Эта гидродинамическая фокусировка позволяет анализировать одну ячейку за один раз посредством лазерного опроса. Оптическая система состоит из различных фильтров, детекторов света и источника света, который обычно представляет собой лазерную линию, генерирующую свет с одной длиной волны на определенной частоте. Это где частицы проходят через по крайней мере один лазерный луч. Лазеры доступны на разных длинах волн, от ультрафиолетового до дальнего красного, а также имеют переменный диапазон уровней мощности (выход / время фотона). Опрос лазерного луча возбуждает любые совместимые флуоресцентные зонды, которые конъюгированы с антителами, заставляя зонды излучать свет (или флуоресцировать) на указанных длинах волн. Чтобы узнать больше о возбуждении и излучении, прочитайте раздел ниже «Флуоресценция и выбор флуорохрома». Детектор перед световым лучом измеряет сигналы прямого рассеянного света (FSC), а детекторы измеряют боковые сигналы рассеянного света (SSC). Флуоресцентные детекторы измеряют интенсивность флуоресцентного сигнала, излучаемого положительно окрашенными клетками и частицами. Внутри проточного цитометра все эти разные световые сигналы разделяются на определенные длины волн и направляются с помощью набора фильтров и зеркал, так что каждый датчик будет обнаруживать флуоресценцию только на определенной длине волны. Эти датчики называются фотоумножительными трубками (ФЭУ). Различные фильтры используются в проточном цитометре для направления фотонов с правильной длиной волны к каждому ФЭУ. Фильтры коротких проходов (SP) позволяют передавать фотоны ниже определенной длины волны, в то время как фильтры длинных проходов (LP) позволяют передачу выше определенной длины волны. Полосовые (BP) фильтры позволяют передавать фотоны с длинами волн в узком диапазоне. Каждый PMT также обнаружит любые другие флуорофоры, излучающие на длине волны, аналогичной флуорофору, который он обнаруживает. Эти световые сигналы преобразуются электронной системой в данные, которые можно визуализировать и интерпретировать с помощью программного обеспечения. Диаграмма ниже иллюстрирует детали и настройку типичного прибора с проточным цитометром.

Основные параметры, которые измеряются этой машиной, включают прямое рассеяние света (FSC), боковое рассеяние света (SSC) и сигналы флуоресцентного излучения. Прямой рассеянный свет (FSC) - это свет, который преломляется ячейкой в ​​прямом направлении и продолжается в том же направлении, в котором свет уже распространялся (обычно со смещением от оси лазерного луча до 20 °). Этот сигнал собирается PMT, называемым прямым каналом рассеяния (FSC), и обычно используется для определения размера частиц. Обычно более крупные частицы производят больше рассеянного света вперед, чем более мелкие, а более крупные ячейки будут иметь более сильный сигнал рассеяния вперед.

Прямые сигналы рассеянного света

Сигналы бокового рассеяния света

Боковой рассеянный свет (SSC) - это свет, который преломляется клетками и движется в направлении, отличном от его первоначального пути (измеренного под углом 90 ° к линии возбуждения). Обычно он предоставляет информацию о гранулярности и сложности ячеек. Клетки с низкой зернистостью и сложностью будут давать меньше рассеянного света, в то время как клетки с высокой зернистостью с высокой степенью внутренней сложности (например, нейтрофилы) будут давать более высокий сигнал бокового рассеяния. Несмотря на то, что он зависит от формы и размера клеток, он более чувствителен к мембранам, цитоплазме, ядру и т. Д. Таким образом, с помощью обнаружения прямого и бокового рассеянного света популяцию клеток часто можно различить на основе характерных различий в размере и гранулярности клеток. На измерения FSC и SSC влияют несколько факторов, а также зависит от качества подготовки образца, поэтому для сбора более подробной информации мы могли бы использовать методы флуоресцентной маркировки с помощью проточной цитометрии.

Отбор флуоресценции и флуорофора (флуорохрома)

Популяции клеток иногда могут быть разделены на основе FSC и SSC, но клетки также могут быть разделены по тому, экспрессируют ли они специфический белок. В этом случае флуорофор обычно используется для окрашивания белка, представляющего интерес. Флуорофоры, используемые для обнаружения белков-мишеней, излучают свет после возбуждения лазером с совместимой длиной волны. Эти флуоресцентно окрашенные клетки или частицы могут быть обнаружены индивидуально. Каждый тип флуоресцентного красителя или метки имеет свой характерный спектр возбуждения и эмиссии, который важен для проведения экспериментов с проточной цитометрией. В настоящее время существует широкий выбор флуорофоров; например, FITC, PerCP, APC, PE, Cy5.5, Alexa Fluors и другие. Флуоресцентно конъюгированные антитела обычно использовались для маркировки специфических структур на клетке для анализа проточной цитометрией. Когда флуоресцирующая ячейка (или частица) проходит через точку опроса и взаимодействует с лазерным лучом, она создает импульс излучения фотонов во времени (пик). Они обнаруживаются PMT и преобразуются электронной системой в импульс напряжения, обычно называемый «событием». Общая высота и площадь импульса измеряются прибором с проточным цитометром, а площадь импульса напряжения будет напрямую зависеть от интенсивности флуоресценции для этого отдельного события. Этим событиям присваиваются номера каналов на основе измеренной интенсивности (площадь импульса). Чем выше интенсивность флуоресценции, тем выше номер канала, которому назначено событие. Этот сигнал может быть усилен путем увеличения напряжения, проходящего через ФЭУ.
Следует отметить, что флуоресцентные сигналы могут также исходить от естественных флуоресцирующих веществ в клетке, таких как восстановленные пиридиновые нуклеотиды (NAD (P) H) и окисленные флавины (FAD), и это называется «автофлуоресценцией». Как правило, более крупные и более гранулированные клетки имеют более высокий уровень аутофлуоресценции из-за увеличения количества флуоресцентных соединений. Уровень автофлуоресценции может быть определен с использованием неокрашенных контролей. Часто полезно иметь неокрашенный контроль или контроль FMO (флуоресценция минус один). Элемент управления FMO поможет вам идентифицировать и контролировать ячейки во время анализа данных.

Нажмите здесь, чтобы узнать больше о контроле FMO

Флуоресцентные светоизлучающие сигналы

Выбор правильного флуорохромного конъюгата

Существует много флуоресцентных молекул, также известных как флуорохромы, флуорофоры или флуоресцентные красители, с потенциальным применением в проточной цитометрии. Эти флуоресцентные молекулы возбуждаются лазерным светом на определенных длинах волн, а затем излучают свет (флуоресцирующий) на другой длине волны. Конъюгируя (предварительно прикрепляя) их к первичным антителам, мы можем создать конъюгированные антитела, которые позволяют проводить анализ проточной цитометрией. Знание свойств каждой сопряженной метки будет важно при выборе правильной метки для вашего эксперимента. Некоторые ключевые особенности, которые нужно знать о флуоресцентных конъюгатных метках, перечислены здесь:

• Максимальная длина волны возбуждения (λex) - максимальная длина волны в спектрах возбуждения (поглощения), измеренная в нанометрах (нм)
• Максимальная длина волны излучения (λem) - максимальная длина волны в спектрах излучения, измеренная в нанометрах (нм)
• Коэффициент экстинкции (ε max) - (также называемый молярной абсорбционной способностью) Способность флуорохрома поглощать свет на данной длине волны, обычно измеряемая на максимальной длине волны возбуждения с единицами М -1 см -1
• Квантовый выход флуоресценции (Φf) - количество фотонов, испускаемых на поглощенный фотон. Важен высокий квантовый выход, и это число колеблется от 0 до 1
• Время затухания флуоресценции (τfl) - интервал времени, после которого количество возбужденных флуоресцентных молекул уменьшается до 1 / е (приблизительно 37%) за счет потери энергии, обычно измеряемой в наносекундах
• Яркость - измеренный выход флуоресценции на флуорофор. Флюорофоры с высокими значениями яркости могут быть использованы для обнаружения целей с низким содержанием. Рассчитывается как произведение коэффициента экстинкции (на соответствующей длине волны возбуждения) и квантового выхода флуоресценции, деленного на 1000, с единицами М -1 см -1
• Сдвиг Стокса - разница между максимальной длиной волны излучения и максимальной длиной волны возбуждения, измеренная в нанометрах
• Laser line - Какие лазерные линии использовать для обнаружения с помощью проточной цитометрии
• Общий набор фильтров - стандартный набор фильтров для микроскопов, обеспечивающий наилучшие результаты визуализации
• Фотостабильность - насколько устойчиво вещество к изменению в результате воздействия света

Нажмите здесь для получения дополнительной информации о свойствах и выборе флуорохрома

После того, как вы выбрали подходящие флуорохромы и антитела для эксперимента с проточной цитометрией, приведенный ниже раздел проведет вас через общую процедуру эксперимента.

Общая экспериментальная процедура

* Это концептуальное объяснение того, как работает проточная цитометрия. Нажмите здесь, чтобы перейти к пошаговым протоколам проточной цитометрии.

Базовые приготовления

Основным требованием для всех типов анализа проточной цитометрии является то, что анализируемые клетки должны находиться в одноклеточной суспензии. Очень важно получить суспензию из одной ячейки, чтобы избежать засорения системы комками. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные из цельной крови посредством центрифугирования в градиенте фиколла, или RBC-лизированной цельной крови, или неприлипающие культивируемые клетки, легко применимы для анализа проточной цитометрией. Прилипшие культивируемые клетки или клетки, присутствующие в твердых органах, должны сначала быть превращены в суспензию отдельных клеток перед анализом потока с использованием ферментативного расщепления или механической диссоциации ткани, соответственно. Затем следует провести механическую фильтрацию, чтобы избежать нежелательных засорений инструмента и получить более качественные данные о расходе. Затем клетки инкубируют в пробирках или планшетах для микротитрования с немечеными или флуоресцентно конъюгированными антителами и анализируют с помощью проточной цитометрической машины.

Нажмите для руководства по подготовке образцов

Окрашивание антител

Прямое окрашивание:

Каждая клетка человека экспрессирует сотни тысяч антигенов клеточной поверхности, которые определяют их тип клетки, биологическую функцию, стадию развития и многое другое. Клетки из разных органов имеют характерные поверхностные антигены, и мы можем использовать антитела, конъюгированные с флуорохромом, специфичные для этих поверхностных маркеров, для анализа этих клеток непосредственно методом проточной цитометрии. При прямом иммунофлуоресцентном окрашивании клетки инкубируют с антителом, непосредственно конъюгированным с флуорофором, таким как PerCP. Это требует только одного этапа инкубации антител и, следовательно, исключает возможность неспецифического связывания со вторичным антителом. Прямое окрашивание выгодно во время внутриклеточного окрашивания, потому что крупные комплексы антитело-флуорофор, включая вторичные антитела, могут быть захвачены и приводить к неспецифическому связыванию, или они могут не попасть в клетку, что не приведет к обнаружению. Если в эксперименте будет окрашено неконъюгированным очищенным антителом, необходимо провести дополнительную стадию окрашивания флуоресцентным конъюгированным вторичным антителом (непрямое окрашивание).

Нажмите для протокола прямого окрашивания

Косвенное окрашивание:

При непрямом окрашивании вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором, обнаруживает первичное антитело, которое не является конъюгированным. Другим доступным методом является система авидин-биотин, посредством которой антитело, конъюгированное с биотином, детектируют с меченным флуорофором авидином. Сегодня существует широкий спектр конъюгированных антител, и при непрямом окрашивании выбор белков-мишеней еще более возрастает. Теперь неконъюгированные первичные антитела, полученные против множества различных мишеней, можно использовать вместе с конъюгированным вторичным антителом для анализа проточной цитометрией.

Нажмите для протокола окрашивания

Внутриклеточное окрашивание:

В дополнение к антигенам клеточной поверхности, процедура внутриклеточного окрашивания позволяет непосредственно измерять антигены (цитокины или факторы транскрипции), присутствующие внутри цитоплазмы или ядра клетки. В этой процедуре требуется фиксация и пермеабилизация клеток. Фиксирующие клетки сохраняют целевой белок в своем первоначальном клеточном местоположении и обычно обеспечивают лучшую стабильность растворимых антигенов и антигенов с коротким периодом полураспада. Обнаружение внутриклеточных антигенов требует пермеабилизации клеток перед окрашиванием, и антитела должны быть приготовлены в буфере пермеабилизации, чтобы гарантировать, что клетки остаются проницаемыми. Эта модифицированная процедура окрашивания позволяет напрямую измерять функциональную активность любой интересующей клетки, присутствующей в крови или других тканях, без дальнейшего разделения. Доступны различные методы фиксации и пермеабилизации для обеспечения доступа антител к внутриклеточным белкам. Для достижения лучших результатов может потребоваться дополнительная стимуляция in vitro некоторым распространенным митогеном, чтобы вызвать увеличение выработки цитокинов внутри клеток. Некоторые общие митогены для этой цели включают PMA, Ca ++ или пептидные эпитопы и ингибитор транспорта белка, Brefeldin A и т. Д. Обнаружение секретируемых белков может быть затруднено, если белки высвобождаются из клетки перед обнаружением или если они быстро разлагаются. В этих ситуациях мы рекомендуем использовать Брефелдин А или другие соединения, которые предотвращают высвобождение белка из аппарата Гольджи. Блок Гольджи, такой как Брефелдин А, будет ингибировать секрецию экспрессированных белков из аппарата Гольджи, задерживая их в обнаруживаемой клетке. Способ внутриклеточного окрашивания может затем использоваться для обнаружения целевого белка.

Нажмите для внутриклеточного протокола окрашивания

Этапы стимуляции, фиксации и проницаемости клеток

Чтобы получить дополнительные экспериментальные советы, обязательно посетите наше руководство по оптимизации, перейдя по ссылке ниже. Успешная процедура окрашивания зависит от оптимизации условий эксперимента, которая включает титрование антител, оптимизированные процедуры фиксации и проницаемости, а также настройку соответствующих контролей. Как только ваши образцы будут подготовлены в виде суспензии отдельных клеток, и у вас будут готовы все элементы управления, просто пропустите их через проточный цитометр в соответствии с инструкциями прибора, чтобы получить результаты ваших данных.

Нажмите здесь для руководства по оптимизации (проточная цитометрия)

Анализ данных

Как выглядят данные проточной цитометрии?

В эксперименте с проточной цитометрией каждая клетка, которая проходит через точку опроса и обнаруживается, будет учитываться как отдельное событие. Каждый тип обнаруживаемого света (прямое рассеяние, боковое рассеяние и каждая другая длина волны флуоресцентного излучения) также будет иметь свой собственный уникальный канал. Данные для каждого события наносятся независимо, чтобы представить интенсивность сигнала света, обнаруженного в каждом канале для каждого события. Эти данные могут быть визуально представлены несколькими различными способами, поэтому вам может потребоваться поиграться с различными типами графиков данных и с тем, как установить свои ворота. Наиболее распространенные типы графиков данных, используемых в проточной цитометрии, включают гистограммы, точечные графики, графики плотности и контурные диаграммы. Поскольку многопараметрический анализ становится более сложным, методы анализа могут даже включать графики более высокого порядка, такие как трехмерные графики и деревья SPADE.

На одномерных графиках гистограммы измеряется только один параметр. Как правило, ось Y - это количество событий (количество клеток), которые показывают данную флуоресценцию, а ось X - относительная интенсивность флуоресценции, обнаруженная в одном канале. Большое количество событий, обнаруженных с определенной интенсивностью, будет представлено в виде пика (или пика) на гистограмме. В идеале будет получен только один отдельный пик, который можно интерпретировать как положительный набор данных (представляющий клетки с желаемыми интересующими характеристиками).

Однако часто анализ потока выполняется на смешанной популяции клеток и приводит к множественным пикам на гистограмме. В этих ситуациях эксперимент с потоком должен быть повторен с соответствующим отрицательным контролем изотипа, который должен помочь идентифицировать положительный набор данных. Для получения положительного результата обратите внимание на изменение интенсивности между отрицательным контролем и положительными образцами, как показано на диаграмме ниже.

Нажмите здесь, чтобы узнать больше о Isotype Controls

Для двумерного анализа данные часто представлены в виде точечных или плотных графиков и контурных диаграмм. Анализируя несколько параметров, мы можем показать взаимосвязь между двумя различными маркерами, что позволяет идентифицировать более сложные фенотипы и выделять важные популяции, представляющие интерес, путем стробирования. Стробирование - это важная процедура анализа данных проточной цитометрии, используемая для выборочной визуализации интересующих клеток и устранения результатов от нежелательных частиц, таких как мертвые клетки и мусор.

Нажмите, чтобы узнать больше о Gating

Точечные и плотностные графики сравнивают 2 или 3 параметра одновременно на точечной диаграмме, где каждое событие представляется в виде одной точки (или точки). Точечный график представляет собой фигуру, которая показывает взаимосвязь между несколькими переменными одновременно, а параметры могут представлять собой любую комбинацию сигналов рассеяния и флуоресценции. Используются три общие комбинации: 1) прямое рассеяние (FSC) и боковое рассеяние (SSC); 2) одноцветный или боковой разброс; и 3) двухцветный флуоресцентный график.
График плотности был разработан как способ показать не только уровни экспрессии, но и относительное количество событий (плотность) в данном регионе. На графике плотности каждая точка или точка представляет отдельную ячейку, которая прошла через точку опроса проточного цитометра. Измерения интенсивности различных каналов представлены вдоль разных осей, так что события с одинаковыми интенсивностями будут объединяться в одной области на диаграмме рассеяния. Графики плотности отлично подходят для просмотра частоты субпопуляций.

В этом примере точечного графика популяции клеток в образце периферической крови могут быть идентифицированы на основе сигналов прямого и бокового рассеяния света. Клеточные популяции отмечены их вероятной идентичностью:

Ссылка на изображение: Райли и Идову. Принципы и применение проточной цитометрии.

Заголовок изображения: Точечный график рассеянного света против бокового рассеяния. Каждая точка представляет отдельную клетку, анализируемую проточным цитометром. Характерное положение различных клеточных популяций определяется различными физическими свойствами, такими как размер и гранулярность клеток, которые подробно описаны ниже:
Мусор: очень мелкие предметы (например, клеточные загрязнения) с низким разбросом вперед и в стороны.
Лейкоциты / моноциты: мелкие и средние клетки с низкой внутренней зернистостью. Эти ячейки производят сигнал среднего рассеяния вперед и низкой интенсивности бокового рассеяния
Гранулоциты: крупные клетки с высокой внутренней зернистостью. Эти ячейки производят высокие интенсивности сигналов прямого и бокового рассеяния.

Как вы можете видеть, некоторые клеточные идентичности могут быть подтверждены прямыми и боковыми профилями рассеяния, но флуоресцентная маркировка с помощью маркера, специфичного для типа клеток, обеспечит большее разрешение и достоверность при профилировании сложных гетерогенных клеточных популяций. На приведенном выше примере графика можно различить лимфоциты и гранулоциты, используя измерения прямого и бокового рассеянного света. Однако среди гранулоцитов есть три различных класса (эозинофилы, базофилы и нейтрофилы), которые трудно различить, используя только светорассеивающие свойства из-за их сходного размера и структуры клеток. Например, чтобы идентифицировать базофилы, мы могли бы селективно пометить их флуоресцентно конъюгированными антителами, которые нацелены на специфические маркеры базофилов.

Другой способ показать плотность ваших данных - использовать контурный график. Контурные графики отображают относительную частоту населения, независимо от количества собранных событий. Контурная диаграмма отображает вероятности контура с соединенными линиями, представляющими одинаковое количество ячеек. Вокруг популяций образуются концентрические кольца, поэтому чем выше плотность, тем ближе кольца на контурной диаграмме. Таким образом, этот график принимает вид географической карты высот с более крутыми островами, где плотность высокая. На 5% контурном графике пять процентов ячеек попадают в каждую контурную линию (как определено графиком). Таким образом, самая внешняя линия содержит 95% клеток; вторая строка содержит 90% и так далее. На приведенном ниже примере контурного графика популяции клеток, которые были представлены в приведенном выше примере графика плотности, теперь вместо этого визуализируются с помощью контурной диаграммы.

Подпись к изображению: контурная диаграмма рассеянного света против рассеянного света. Плотность представлена ​​контурными линиями, и, как и точечный график, характерное положение различных популяций клеток определяется различными физическими свойствами, такими как размер и гранулярность клеток.

Одним из недостатков контурных графиков является то, что информация о редких популяциях не видна, поскольку эти диаграммы не очень хорошо показывают выбросы. На 5% контурном графике 5% ячеек будут выходить за пределы последней контурной линии. В этих ситуациях некоторые программы анализа данных будут иметь возможность добавлять выбросы к большинству типов графиков. Другая стратегия заключается в объединении контурного графика с точечным графиком, что позволяет отображать как оценку плотности, так и информацию о редких событиях. Крайне важно выбрать лучший способ передачи ваших данных, чтобы помочь вам убедить своих коллег в результатах, которые вы предлагаете. Обязательно выделите ваши результаты, используя правильные схемы, чтобы точно отражать ваши данные без путаницы.